Identificación de infiltración inmune.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14153 (2023) Citar este artículo

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La aterosclerosis es una respuesta inflamatoria crónica impulsada por lípidos de los sistemas inmunológicos innato y adaptativo, y es responsable de varios eventos isquémicos cardiovasculares. El presente estudio tuvo como objetivo determinar biomarcadores relacionados con la infiltración inmune en placas ateroscleróticas carotídeas (CAP). Los perfiles de expresión génica de CAP se extrajeron de la base de datos Gene Expression Omnibus. Los genes expresados diferencialmente (DEG) entre los CAP y los grupos de control fueron seleccionados mediante el paquete "limma" en el software R. La infiltración de células inmunes entre los CAP y los grupos de control se evaluó mediante el análisis de enriquecimiento del conjunto de genes de una sola muestra. Las células inmunitarias infiltrantes clave en el grupo CAP se examinaron mediante la prueba de Wilcoxon y la regresión del operador de selección y contracción mínima absoluta. El análisis de la red de coexpresión de genes ponderados se utilizó para identificar genes relacionados con células inmunitarias. Los genes centrales se identificaron mediante la red de interacción proteína-proteína (PPI). Se realizó un análisis de la curva característica operativa del receptor para evaluar la capacidad del gen para diferenciar entre los CAP y los grupos de control. Finalmente, construimos una red de factores de transcripción de genes miARN de genes centrales utilizando la base de datos ENCODE. Se identificaron once tipos diferentes de células relacionadas con la infiltración inmune entre los CAP y los grupos de control. Se obtuvo un total de 1.586 genes relacionados con la inmunidad expresados diferencialmente mediante la intersección entre DEG y genes relacionados con la inmunidad. Se examinaron veinte genes centrales a través de la red PPI. Finalmente, se identificaron siete genes (BTK, LYN, PTPN11, CD163, CD4, ITGAL e ITGB7) como genes centrales de las CAP, y estos genes pueden servir como objetivos farmacológicos estimables para los pacientes con CAP.

La acumulación crónica de placas impulsadas por lípidos en la íntima subendotelial de las arterias eventualmente conduce a una estenosis significativa de la luz, un suministro insuficiente de flujo sanguíneo e hipoxia crítica del tejido1. Las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades de las arterias periféricas y las enfermedades cerebrovasculares suelen ser causadas por la aterosclerosis. Las placas ateroscleróticas carotídeas (CAP) son también la patología subyacente más común del accidente cerebrovascular isquémico. Estudios anteriores han mejorado enormemente nuestra comprensión de la etiología de la aterosclerosis. Sin embargo, todavía falta práctica clínica para trasladar la ciencia fundamental al paciente2. Por lo tanto, existe la necesidad de filtrar genes centrales para diferenciar a los pacientes con CAP de los controles.

El mecanismo clave del desarrollo de la aterosclerosis es una respuesta inmune a la inflamación impulsada por lípidos en la capa íntima subendotelial de las arterias. Los macrófagos inflamatorios y la formación de células espumosas durante la progresión de la placa desempeñan funciones particularmente importantes en la aterogénesis y han sido ampliamente revisados anteriormente1,3. Las células inmunes innatas y adaptativas contribuyen al desarrollo de la inflamación arterial crónica4. La distribución anormal y los tipos desproporcionados de células inmunes también están asociados con la aterogénesis5. Por lo tanto, la exploración de diversas alteraciones de las células inmunitarias en la aterogénesis podría ofrecer nuevos conocimientos sobre la etiología, el diagnóstico y el tratamiento de las CAP.

Las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS), por ejemplo, microarrays, secuenciación de ARN y secuenciación de células individuales, generan abundantes datos de expresión genética que son apropiados para estudiar la distribución de células inmunes en los tejidos lesionados6,7. La identificación de tipos, composición y estados funcionales de las células en la aterogénesis es crucial para comprender la contribución celular8,9,10. Perfiles de expresión genética; por ejemplo, se podrían utilizar microarrays y secuenciación de ARN para identificar genes expresados diferencialmente (DEG) y vías de señalización que participan en la aterogénesis11,12. Mediante la combinación con técnicas de secuenciación, el análisis bioinformático podría dilucidar las relaciones entre los DEG y la aterogénesis e ilustrar la red de interacción de genes centrales, ARN nuclear heterogéneo (hnRNA), factores transcripcionales (TF), microRNA (miRNA) y proteínas13,14.

En el presente estudio, los datos de microarrays se descargaron de conjuntos de datos Gene Expression Omnibus (GEO) y se utilizó el algoritmo de análisis de enriquecimiento de conjunto de genes de muestra única (ssGSEA) para evaluar la abundancia y los tipos de células inmunitarias entre los CAP y los grupos de control. También identificamos los genes centrales relacionados con la infiltración inmune en pacientes con CAP.

GEO es un depósito público internacional de conjuntos de datos genómicos funcionales de secuencias y microarrays depositados por investigadores. Los conjuntos de datos de expresión génica GSE43292 y GSE100927 se utilizaron para el análisis genético diferencial entre los CAP y los grupos de control. En GSE43292 se incluyeron un total de 32 CAP obtenidos de tejido de endarterectomía y 32 tejidos carotídeos macroscópicamente intactos adyacentes a los CAP. En GSE100927 se incluyeron un total de 29 CAP y 12 tejidos de arteria carótida normales. El conjunto de datos GSE43292 se utilizó como conjunto de descubrimiento, mientras que el conjunto de datos GSE100927 se utilizó para la validación.

Se utilizó el paquete "limma" en el software R15 para realizar la expresión diferencial de los ARNm. El valor de P ajustado, que se ajustó mediante el método de Benjamini y Hochberg (BH), se utilizó para corregir resultados falsos positivos en GSE43292. Todos los DEG (valor de p ajustado <0,001) entre los CAP y los grupos de control se seleccionaron para un análisis adicional.

Para evaluar las posibles funciones biológicas de los DEG, se realizaron análisis de enriquecimiento de vías de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizando el paquete “clusterProfiler”16,17. Las categorías funcionales con un valor de P ajustado de <0,05 (ajustado por el método de Benjamini y Hochberg (BH)) se consideraron vías significativas.

El nivel de infiltración de células inmunes (células B activadas, células T CD4 + activadas, células T CD8 + activadas, CD activadas, células asesinas naturales CD56bright, células asesinas naturales CD56dim, células T CD4 + de memoria central, células T CD8 + de memoria central, Células T CD4+ de memoria efectora, células T CD8+ de memoria efectora, eosinófilos, células T gamma-delta, células B inmaduras, CD inmaduras, macrófagos, mastocitos, células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), células B de memoria, monocitos, naturales células asesinas, células T asesinas naturales, neutrófilos, CD plasmocitoides, células T reguladoras, células T auxiliares foliculares, células T auxiliares tipo 1, células T auxiliares tipo 17 y células T auxiliares tipo 2) se determinó mediante el algoritmo ssGSEA en el “ GSVA” paquete de software R18. El conjunto de genes de fondo se recopiló de la literatura anterior18. El algoritmo ssGSEA definió una puntuación que representa el grado de enriquecimiento absoluto de diferentes conjuntos de genes de células inmunes en cada muestra. Las diferencias en la infiltración de células inmunes entre los CAP y los grupos normales se analizaron mediante la prueba de Wilcoxon (P <0,05). Las células inmunitarias distintivas que podrían usarse para diferenciar entre muestras de enfermedad y de control se examinaron utilizando el análisis de regresión del operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO). La característica de la regresión LASSO es que cuando se establece el modelo lineal generalizado, los requisitos de datos son extremadamente bajos, por lo que se aplica ampliamente. Al aplicar un castigo de regresión a todas las variables, el coeficiente de las variables relativamente poco importantes pasa a ser 0, lo que se excluye del modelado. Luego se seleccionan las variables independientes con gran influencia sobre las dependientes y se calcula el coeficiente de regresión correspondiente. Finalmente, se descartan características importantes. Las células inmunitarias que se cruzan de los dos métodos se extrajeron como células inmunitarias clave de los CAP para el estudio posterior.

El paquete R “WGCNA” se utilizó para encontrar genes y módulos clave infiltrados relacionados con las células inmunitarias19. Primero, se realizó una agrupación jerárquica en los CAP para detectar y eliminar valores atípicos. A continuación, utilizamos la función pickSoftThreshold para encontrar una potencia de umbral suave β de acuerdo con las redes estándar sin escala. Las adyacencias entre todos los genes filtrados se calcularon utilizando la función de potencia adyacente a la matriz de correlación de Pearson para transformar los datos en una matriz de superposición topológica (TOM), y se calculó la disimilitud correspondiente (1-TOM). Luego se calculó la disimilitud de los genes propios del módulo para analizar más a fondo el módulo.

Los DEIRG se obtuvieron cruzando genes de módulo y DEG. La red PPI de los DEIRG se construyó utilizando la base de datos STRING20 con la puntuación de interacción mínima requerida de 0,7 (confianza más alta). Posteriormente, el módulo central de la red PPI fue examinado mediante el complemento de software Cytoscape Molecular Complex Detección (MCODE)21 con los siguientes parámetros predeterminados: límite de grado = 2, límite de puntuación de nodo = 0,2 y puntuación k = 2. Los genes en el módulo central se consideró como los genes centrales.

El análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC) es un método bien establecido para evaluar qué tan bien un marcador es capaz de discriminar entre individuos que experimentan el inicio de la enfermedad y aquellos que no. Se trazó la curva ROC y el área bajo la curva (AUC) se calculó con el paquete "pROC" del software R22 para evaluar la capacidad de los genes centrales seleccionados para diferenciar entre los CAP y los grupos de control.

Los coeficientes de correlación entre los genes se calcularon mediante el análisis del coeficiente de correlación de Spearman utilizando el paquete "corrplot" del software R23. Además, la similitud funcional entre los genes se determinó utilizando la media geométrica de similitudes semánticas en componentes celulares (CC) y funciones moleculares (MF) a través del paquete “GOSemSim”24. Para investigar más a fondo la relación entre los genes centrales y las células inmunitarias, también analizamos la correlación entre los genes centrales y las células inmunitarias que se infiltran diferencialmente.

La ontología de la enfermedad (DO) anota genes humanos en el contexto de la enfermedad. Se utilizó el paquete "DOSE" del software R25 para analizar el enriquecimiento de OD de los genes de diagnóstico. Los términos DO con enriquecimiento significativo se seleccionaron sobre la base del valor de P ajustado al umbral de <0,05. La base de datos de interacción entre genes y fármacos (DGIdb) es un recurso para la interacción entre genes y fármacos26. Buscamos en la base de datos DGIdb para predecir posibles fármacos o compuestos moleculares que interactuaban con los genes de diagnóstico y visualizamos la red de interacción fármaco-gen mediante el software Cytoscape.

Los miARN o TF controlan la expresión génica mediante la interacción con sus genes diana durante la etapa postranscripcional o transcripcional. El proceso de implementación concreto se logró a través de la base de datos miRnet (https://www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml), que podía seleccionar la base de datos en segundo plano al realizar predicciones de TF. Por lo tanto, se utilizó la base de datos ENCODE para predecir los miARN y TF que interactuaban con los genes centrales21. Visualizamos la red miARN-gen-TF utilizando el software Cytoscape.

Se identificaron un total de 2378 DEG (1248 regulados al alza y 1130 regulados a la baja) en los CAP en comparación con los grupos normales (Fig. 1A). La expresión de DEG en pacientes con CAP y grupos normales se muestra en un mapa de calor (Fig. 1B). Para explorar los posibles mecanismos moleculares de estos DEG, realizamos análisis de enriquecimiento de GO y KEGG.

Análisis de identificación y enriquecimiento de DEG. (A) Mapa de volcanes de DEG. Los puntos azules representan genes que estaban significativamente regulados negativamente en los CAP, los puntos rojos representan genes que estaban significativamente regulados positivamente en los CAP. (B) Mapa de calor de DEG. La ordenada representa las muestras y la abscisa representa los DEG. Los mapas de calor fueron producidos por pheatmap (1.0.12 Kolde R (2019). _pheatmap: Pretty Heatmaps_. Paquete R versión 1.0.12, < https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap > .) (C ) Análisis de enriquecimiento de la función biológica GO de genes regulados negativamente. (D) Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de genes regulados negativamente. (E) Análisis de enriquecimiento de la función biológica GO de genes regulados positivamente. (F) Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de genes regulados negativamente.

Con respecto a los genes regulados negativamente, el análisis GO reveló que las principales categorías funcionales en los procesos biológicos (BP) eran "proceso del sistema muscular", "contracción muscular" y "desarrollo de tejido Wnt". Para el componente celular (CC), los principales términos GO enriquecidos fueron "unión célula-célula", "fibra contráctil" y "miofibrillas". Los términos de función molecular (MF) más enriquecidos fueron "unión de actina", "calmodulina" y "constituyente estructural del músculo" (Fig. 1C). El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG indicó que los DEG estaban involucrados principalmente en la "regulación del citoesqueleto de actina", la "adhesión focal", la "vía de señalización del calcio" y la "contracción del músculo liso vascular" (Fig. 1D).

Con respecto a los genes regulados positivamente, el análisis GO reveló que las principales categorías funcionales en BP eran "activación de células T", "regulación positiva de la producción de citoquinas" y "vía de señalización que regula la respuesta inmune". Para el componente celular (CC), los principales términos GO enriquecidos fueron "membrana vacuolar", "membrana de vacuola lítica" y "membrana lisosomal". Los términos de MF más enriquecidos fueron "actividad reguladora de GTPasa", "actividad reguladora de nucleósido-trifosfatasa" y "actividad activadora de GTPasa" (Fig. 1E). El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG indicó que los DEG estaban involucrados principalmente en el "lisosoma", la "tuberculosis" y la "vía de señalización de quimiocinas" (Fig. 1F).

Dado que el microambiente inmunológico está estrechamente relacionado con la aparición y la progresión de la enfermedad, realizamos un análisis de infiltración inmune. En primer lugar, se utilizó el paquete GSVA para calcular las puntuaciones ssGSEA de 28 tipos diferentes de células inmunitarias en cada muestra. A continuación, comparamos la infiltración de células inmunes entre CAP y grupos normales. La Figura 2A muestra el nivel de infiltración de las células inmunes en CAP y grupos normales. Para comparar las puntuaciones del enriquecimiento absoluto de diferentes conjuntos de genes de células inmunitarias en cada muestra, los resultados de la prueba de Wilcoxon se presentan en la Fig. 2B, que mostró 27 tipos de células inmunitarias con un valor de P <0,05. Posteriormente, el paquete R glmnet realizó un análisis de regresión logística LASSO para comparar las células inmunes características entre muestras AP y normales. Los resultados de LASSO se presentaron en la Fig. 2C, D, que mostró 11 tipos de células inmunes que podrían usarse como células distintivas de CAP. Se cruzaron las células inmunitarias diferenciales de la prueba de Wilcoxon y las células inmunitarias distintivas de la regresión LASSO, y se obtuvieron y utilizaron 11 células inmunitarias como células inmunitarias clave de las CAP; estos incluían células B activadas, células T CD8 + activadas, células asesinas naturales CD56bright, células T CD8 + de memoria central, células T CD4 + de memoria efectoras, células T CD8 + de memoria efectoras, eosinófilos, células T gamma delta, células B de memoria, monocitos y células T asesinas naturales. Estos fueron significativamente mayores en los CAP que en los grupos normales.

Análisis de células inmunes infiltrantes. (A) Mapa de calor de la infiltración de células inmunes. La abscisa representa la muestra y la ordenada representa el tipo de célula inmune (N = 28). El color representa la cantidad (o actividad) de células inmunitarias en cada muestra. Los mapas de calor fueron producidos por pheatmap (1.0.12 Kolde R (2019). _pheatmap: Pretty Heatmaps_. Paquete R versión 1.0.12, < https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap > .) (B ) Diagrama de caja de la infiltración de células inmunitarias entre CAP y grupos de control. La abscisa representa el tipo de célula inmune y la ordenada representa la puntuación ssGSEA. El cuadro azul representa los grupos de control y el cuadro rojo representa los CAP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. El gráfico muestra que sólo los 27 tipos de células inmunitarias son significativamente diferentes. (C)(D) Se identificaron células inmunes diferenciales mediante el algoritmo LASSO.

Para detectar genes asociados con las células inmunitarias infiltrantes clave, se construyó la red de coexpresión utilizando un análisis de red de coexpresión de genes ponderados (WGCNA). Primero, se utilizó la distancia euclidiana de expresión génica para realizar una agrupación jerárquica de muestras y se excluyeron los datos atípicos (Fig. 3A, B). A continuación, utilizando el poder de umbral suave de 12, se identificaron un total de 12 módulos (Fig. 3C, D). Para evaluar más a fondo la relación entre los módulos y las células inmunes infiltradas, se realizaron mapas de calor de correlación módulo-rasgo (Fig. 3E). Observamos que las correlaciones entre los módulos azul y marrón y 11 células inmunes diferenciales fueron mayores que las de otros módulos (Fig. 3E). En consecuencia, 3.719 genes del módulo en los módulos azul y marrón se consideraron genes relacionados con el sistema inmunológico para estudios adicionales.

Descubrimiento de módulos y genes relacionados con el sistema inmunológico. (A) Árbol de agrupación de muestra. El número total de muestras fue N = 64 y fue necesario eliminar la muestra atípica GSM1060144. (B) Árbol de agrupación de muestras después de eliminar muestras atípicas. El número total de muestras es N = 63. (C) Filtrado del umbral suave. Establezca el umbral suave en 12. (D) Árbol de agrupación jerárquica. La parte superior de la figura representa la agrupación de genes, la parte inferior representa módulos de genes, formando un total de 12 módulos, y el módulo gris representa genes no clasificados en módulos. (E) Módulo: mapa de calor de correlación de rasgos. Los valores en los cuadrados representan los coeficientes de correlación de Pearson y los valores p correspondientes calculados por pares entre rasgos y módulos. Los mapas de calor fueron producidos por WGCNA 1.71 Langfelder P y Horvath S, WGCNA: un paquete R para análisis de redes de correlación ponderada. BMC Bioinformática 2008, 9:559 https://doi.org/10.1186/1471-2105-9-559, http://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/.

Se cruzaron los 3.719 genes relacionados con el sistema inmunológico y los 2.378 DEG obtenidos, y se obtuvo un total de 1.586 DEIRG (Fig. 4A). El PPI se analizó con 1586 DEIRG utilizando la base de datos STRING (Fig. 4B). Toda la red PPI se analizó utilizando MCODE, después de lo cual los genes en el módulo central se eligieron como genes centrales (Fig. 4C). Finalmente, se identificaron 20 genes centrales, a saber, ITGB7, PTPN11, CD68, JAM3, ITGA8, ITGAE, IL10, ITGAL, ITGA4, ITGA9, CD4, CD1C, PTPRC, CD163, TNF, BTK, CD86, MRC1, LYN y CD80. . El PPI de los 20 genes centrales se muestra en la Fig. 4D.

Identificación de genes centrales por red PPI. (A) Diagrama de Venn de la intersección de DEG y genes relacionados con el sistema inmunológico. El área verde representa DEG, el área roja representa genes relacionados con el sistema inmunológico y la superposición representa DEIRG (N = 1586). (B) Red de interacción de proteínas. Los nodos representan proteínas relacionadas con el ritmo circadiano expresadas diferencialmente. La línea entre nodos indica que existe una interacción entre ellos. (C) Puntuación MCODE1 = 9,368. Seleccione todos los genes en este módulo (Top1) como genes clave (N = 20). (D) El PPI de 20 genes centrales.

Primero, se visualizaron los niveles de expresión de los genes centrales. El nivel de expresión de ITGB7, CD68, ITGAE, IL10, ITGAL, ITGA4, CD4, CD1C, PTPRC, CD163, TNF, BTK, CD86, MRC1, LYN y CD80 fue mayor, y el nivel de expresión de PTPN11, JAM3, ITGA8, y ITGA9 fue menor en pacientes con CAP (Fig. 5A). A continuación, construimos curvas de características operativas del receptor (ROC) para los genes centrales y calculamos los valores correspondientes del área bajo la curva (AUC) (Fig. 5B). Los resultados mostraron que las AUC de los genes centrales (BTK, LYN, PTPN11, CD163, CD4, CD68, ITGAL, ITGB7 e ITGAE) eran superiores a 0,8. Los niveles de expresión de los genes centrales se verificaron aún más en el conjunto de datos de validación GSE100927 (Fig. 5C). Había 19 genes centrales (excepto CD86) con tendencias de expresión similares a las del conjunto descubierto. Como se muestra en la Fig. 5D, los valores de AUC de los 18 genes centrales (excepto CD86 e ITGAE) también fueron superiores a 0,7. Por lo tanto, se seleccionaron los 18 genes centrales validados, a saber, ITGB7, PTPN11, JAM3, ITGA8, IL10, ITGAL, ITGA4, ITGA9, CD4, CD1C, PTPRC, CD163, TNF, BTK, CD68, MRC1, LYN y CD80, y Se descubrió que estos genes tenían la capacidad de diferenciar entre los CAP y los grupos de control.

Verificación de genes Hub. (A) Diagrama de caja de genes centrales de expresión diferencial entre CAP y grupos de control en el conjunto de datos de descubrimiento. (B) Validación de la curva ROC basada en la expresión de genes clave en el conjunto de datos de descubrimiento. El valor AUC representa el área bajo la curva. (C) Diagrama de caja de genes centrales de expresión diferencial entre CAP y grupos de control en el conjunto de datos de validación. (D) Validación de la curva ROC basada en la expresión de genes clave en el conjunto de datos de validación.

Para demostrar las correlaciones entre los genes centrales, hicimos la Fig. 6A. Se encontró que los genes CD80, ITGA4, CD1C, PTPRC, MRC1, CD68, CD163, BTK, CD4, LYN, ITGAL, ITGB7, IL10 y TNF estaban correlacionados positivamente entre sí. Además, los genes ITGA9, PTPN11, JAM3 e ITGA8 también se correlacionaron positivamente entre sí. Sin embargo, los genes CD80, ITGA4, CD1C, PTPRC, MRC1, CD68, CD163, BTK, CD4, LYN, ITGAL, ITGB7, IL10 y TNF se correlacionaron negativamente con los genes ITGA9, PTPN11, JAM3 e ITGA8. La comparación de similitudes funcionales de genes o productos genéticos es un contenido importante de la investigación en ciencias biológicas, que tiene una amplia gama de aplicaciones en la predicción funcional de macromoléculas biológicas, agrupación de genes, análisis de redes biológicas y detección de genes relacionados con enfermedades. Calcular la similitud funcional entre genes se ha convertido en el trabajo básico de la investigación bioinformática. Por lo tanto, clasificamos los genes centrales según la similitud funcional promedio. La Figura 6B demostró que ITGAL, ITGB7 e ITGA4 eran los tres genes centrales principales y podrían desempeñar funciones clave en los CAP.

Correlación de expresión, similitud funcional y análisis de correlación de células inmunitarias de los genes centrales. (A) Diagrama de coeficiente de correlación de expresión del gen Hub. (B) Similitud funcional de genes hub. La abscisa representa la puntuación de similitud funcional del gen, la ordenada representa el nombre del gen y los contenedores de diferentes colores representan diferentes genes. (C) Mapa de calor de asociación entre genes centrales y células infiltrantes inmunes diferenciales. Los mapas de calor fueron producidos por ggcorrplot 0.1.4 Kassambara A (2022). _ggcorrplot: Visualización de una Matriz de Correlación usando 'ggplot2'_. Paquete R versión 0.1.4, https://CRAN.R-project.org/package=ggcorrplot.

Además, necesitamos aclarar la asociación entre los genes centrales y las células inmunes que se infiltran diferencialmente. El resultado del análisis de correlación entre los genes centrales y las células inmunitarias que se infiltran diferencialmente indicó que los genes ITGB7, IL10, ITGAL, ITGA4, CD4, CD1C, PTPRC, CD163, TNF, BTK, CD68, MRC1, LYN y CD80 estaban correlacionados positivamente. con células inmunes que se infiltran diferencialmente, mientras que los genes PTPN11, JAM3, ITGA8 e ITGA9 se correlacionaron negativamente con células inmunes que se infiltran diferencialmente (Fig. 6C).

Para explorar el papel de los DEG en otras enfermedades, el análisis de Ontología de Enfermedades (DO) mostró que los genes centrales estaban enriquecidos principalmente en "leucemia linfoblástica", "enfermedad infecciosa por virus de inmunodeficiencia humana", "esclerosis múltiple" y otros términos ( Figura 7A). Para buscar posibles fármacos terapéuticos, realizamos un análisis de detección de fármacos de molécula pequeña. Como se muestra en la red de interacción fármaco-gen (Fig. 7B), se recuperaron de la base de datos DGIdb un total de 191 fármacos o compuestos moleculares correspondientes a 11 genes centrales. La ciclosporina podría regular 4 genes centrales, a saber, CD80, IL10, ITGAL y TNF. Además, 68 fármacos o compuestos moleculares que incluían alteplasa y atorvastatina regularon el gen TNF.

DO Análisis de enriquecimiento de los genes centrales e identificación de fármacos potenciales. (A) Diagrama de burbuja de enriquecimiento de DO. Sólo se muestran los 10 tipos de enfermedades principales. (B) Diagrama de la red de interacción gen-fármaco, la línea entre los dos indica una interacción.

Para explorar las vías de los genes centrales, construimos una red reguladora de factor de transcripción (TF) de genes de miARN obteniendo las interacciones regulatorias entre los miARN/TF y los genes centrales en la base de datos ENCODE (Fig. 8). Se incluyeron un total de 384 nodos (18 genes centrales, 311 miARN y 55 TF) y 549 bordes en la red miARN-gen-TF. Los cinco miARN principales que regularon la mayor cantidad de genes centrales fueron hsa-mir-155-5p, hsa-mir-7-5p, hsa-mir-1291, hsa-mir-328-3p y hsa-mir-551b-. 3p. Los cinco genes reguladores SP1, NFKB1, SPI1, RELA y CREB1 ocuparon los primeros puestos entre los TF. LYN, PTPN11 y TNF fueron los tres principales genes centrales a los que se dirigen los miARN, y IL10 y TNF70 fueron los dos principales genes centrales a los que se dirigen los TF.

Construcción de la Red Reguladora de miARN-gen-TF. Gen central, TF, red reguladora mirNA. El área roja representa el gen central, el área verde representa los TF, el área violeta representa el miARN y las líneas indican la existencia de una relación regulatoria.

Los NAC son una de las principales causas de ictus27. Los émbolos formados por la rotura de la placa son los principales responsables de la oclusión vascular cerebral. Por lo tanto, la detección de genes hub en pacientes con riesgo de sufrir un accidente cerebrovascular y la determinación de los posibles objetivos inmunoterapéuticos para los CAP son fundamentales para prevenir eventos adversos cerebrovasculares28. Para identificar los genes centrales de los CAP, analizamos los DEG corregulados en el conjunto de datos relacionados con los CAP GSE43292. Mediante el uso de métodos bioinformáticos integrados, se identificaron 11 tipos significativamente diferentes de células inmunes entre los CAP y los grupos de control, y 7 genes centrales (BTK, LYN, PTPN11, CD163, CD4, ITGAL e ITGB7) pueden servir como biomarcadores potenciales para diferenciar entre CAP y muestras de control. Aunque en la literatura se han propuesto varias firmas relacionadas con la inmunidad, proponemos por primera vez nuevos biomarcadores relacionados con la infiltración inmune en la aterosclerosis de la arteria carótida.

Estudios anteriores han seleccionado DEG a través del conjunto de datos GEO29,30,31. Diferentes métodos y criterios han llevado a resultados diferentes para los DEG. Chen et al. Se examinaron 335 genes regulados positivamente y 81 genes regulados negativamente. Según GSEA de un solo gen, los conjuntos de genes correlacionados con la inflamación y la respuesta inmune estaban altamente regulados en el grupo de alto nivel de expresión de NCF2, IQPAG2 y CD8629. Liu y cols. obtuvieron 758 DEG y descubrieron que los genes ITGAM y ACTN2 mostraban altos niveles de expresión en la red PPI31. Liu y cols. identificaron 680 genes regulados positivamente y 875 genes regulados negativamente en muestras de placa. El gen IGFBP6 está regulado negativamente en CAP inestables; por tanto, puede ser una molécula importante en la formación de placas inestables30. Ji et al. investigó los cambios en la microbiota intestinal y los metabolitos plasmáticos en pacientes con CAP y grupos de control mediante el uso de secuenciación del ADN ribosomal y metabolómica. Entre 132 DEG, el gen FABP4 mostró el mayor |log2(cambio de veces)|32. Estos estudios identificaron sólo DEG entre placas estables e inestables; sin embargo, nuestra investigación identificó DEG entre los CAP y los grupos de control, lo cual es convincente y valioso.

Wang y cols. identificó genes clave involucrados en la progresión de CAP mediante el uso del Identificador de abundancia de células inmunes (ImmuCellAI). Demostraron que las células T y las células mieloides representan una gran proporción de las células inmunitarias ateroscleróticas y que los macrófagos y las células dendríticas (DC) revelaron enriquecimientos diferenciales en los CAP y en los grupos de control13. Al utilizar WGCNA, Zhao et al. detectaron un gen asociado a la edad como biomarcador de CAPs, y experimentos in vitro sugieren que el gen CEBPB participa en la progresión de CAPs33. Los estudios antes mencionados tuvieron como objetivo describir el cambio en la abundancia de 24 tipos de células inmunes en los tejidos ateroscleróticos; sin embargo, a diferencia de investigaciones anteriores, nuestro objetivo fue identificar genes diferenciales asociados con el cambio en la abundancia de células inmunes.

El presente estudio es el primero en combinar la ssGSEA, la prueba de Wilcoxon, el modelo de regresión LASSO y WGCNA para identificar las células inmunes infiltrantes clave y los genes entre los CAP y los grupos de control, y propone biomarcadores relacionados con la infiltración inmune para los CAP.

Al analizar las características inmunes de los CAP, encontramos diferencias significativas para 11 células inmunes (células B activadas, células B de memoria, células T gamma-delta, células T asesinas naturales, células T CD8 + activadas, células T CD8 + de memoria central, células efectoras células T CD8 + de memoria, células T CD4 + de memoria efectoras, células asesinas naturales, eosinófilos y monocitos) entre los CAP y los grupos de control, lo que sugiere que los sistemas inmunológicos innato y adaptativo desempeñan un papel fundamental en el impulso de la inflamación crónica asociada con los CAP en el pared arterial. Las células T citotóxicas (células T CD8+), las células T asesinas naturales (NKT), las células NK y las células T gamma-delta se encuentran entre los tipos más importantes de células asesinas34,35. Todos los linfocitos asesinos están implicados en el proceso de CAP a través de diferentes métodos como mecanismos dependientes de citotoxinas, FasL/TRAIL y/o citoquinas que eventualmente completan el proceso de ruptura de CAP36,37. Las células asesinas abundan en las placas inestables, lo que refuerza su papel en la rotura de las CAP y su implicación en la progresión de la aterosclerosis de la arteria carótida. Los diferentes tipos de células B (B1 y B2) exhiben efectos dispares en el desarrollo de CAP. Por ejemplo, las células B1 producen anticuerpos IgM y muestran un efecto ateroprotector, mientras que las células B2 secretan anticuerpos IgG e IgE, que promueven el desarrollo de CAP38. Por lo tanto, especulamos que la inmunidad está estrechamente relacionada con las CAP y puede afectar los efectos inmunoterapéuticos en pacientes con CAP a través de mecanismos relacionados con los linfocitos asesinos.

Entre los genes clave seleccionados por MCODE sobre la base de la red de coexpresión DEG, los genes LYN y BTK mostraron la conectividad más notable. Con una similitud funcional promedio alta, los genes ITGAL e ITGB7 pueden desempeñar un papel vital en la red de interacción. La curva ROC de estos genes mostró que los valores de AUC fueron 0,854, 0,852, 0,851, 0,843, 0,844, 0,827 y 0,825 para LYN, BTK, PTPN11, CD4, CD163, ITGAL e ITGB7, respectivamente.

LYN, un miembro de las proteínas tirosina quinasas, gestiona principalmente procesos celulares fundamentales, como el crecimiento y la diferenciación celular, mediante la inhibición de la activación inmune mediante el reclutamiento de proteínas inhibidoras y fosfatasas lipídicas39. Estudios anteriores han demostrado que LYN regula las vías tanto positivas como negativas en la inmunidad relacionada con las células B40. LYN también es un regulador crucial de las vías de señalización de los receptores inmunitarios y promueve vías de señalización tanto proinflamatorias como supresoras en las células inmunitarias (p. ej., neutrófilos, CD, monocitos y macrófagos) y linfocitos B41. Esto también concuerda con los resultados del presente estudio de que las 11 células inmunes diferenciales son principalmente linfocitos B y células inmunes innatas.

Se requiere BTK para activar vías que promueven la supervivencia de los linfocitos42 y para regular la secreción de quimiocinas y el proceso de adhesión de células B mediante la activación de la fosfolipasa Cg2 (PLCg2)43. Además, BTK parece desempeñar un papel clave en la inmunidad innata al modular muchas redes de señalización inmunitaria del sistema inmunológico innato44. BTK también es importante para el desarrollo de neutrófilos45 y para la activación del inflamasoma NLRP3 en macrófagos46 y CD47. También encontramos que los genes BTK y LYN tenían la mayor similitud de expresión con 0,94, lo que indica que es probable que ambos genes ejerzan el mismo efecto en el desarrollo de CAP.

CD4 es una glicoproteína de membrana expresada en los linfocitos T auxiliares e interactúa con moléculas de inmunoglobulina de casi todas las clases y subclases48. Se ha encontrado infiltración de linfocitos T en placas escleróticas en diversas etapas de las CAP, entre las cuales los linfocitos T efectores CD4+ son los más importantes49,50. Las células T CD4+ son los mediadores principales de las CAP y participan en todas las etapas de las enfermedades ateroscleróticas. Los receptores de quimiocinas (p. ej., CCR5 y CXCR6) median la infiltración de células T en los CAP51,52.

CD163 se expresa exclusivamente en monocitos (baja expresión) y macrófagos (alta expresión)53. IL-6, IL-10 y otras citoquinas antiinflamatorias inducen la expresión de CD163, mientras que IL-4, TNF-α, IFN-γ y otros factores inflamatorios inhiben la expresión de CD16354. Parece evidente que sólo una subpoblación de M2 es CD163+; por lo tanto, CD163 se utiliza a menudo como marcador M255. La alta expresión de CD163 en macrófagos es una característica de los tejidos inflamatorios. Estudios anteriores han demostrado que los glucocorticoides ejercen efectos antiinflamatorios sobre los macrófagos al afectar su fenotipo y así regular la expresión de citoquinas56.

La proteína tirosina fosfatasa N11 (PTPN11), también conocida como proteína tirosina fosfatasa 2 (SHP2) que contiene el dominio de homología 2 de Src, es una importante proteína tirosina fosfatasa (PTP) que desempeña un papel integral en múltiples eventos celulares, incluida la migración celular, la diferenciación, supervivencia y metabolismo57. Chen J et al. encontraron que la inhibición de la actividad de SHP2 podría prevenir el desarrollo de CAP al inhibir la proliferación de células del músculo liso vascular58.

La integrina β7 (ITGB7) se expresa en la superficie de los leucocitos y desempeña un papel esencial en la localización de las células inmunitarias59. Estudios anteriores han demostrado que ITGB7 se activa constitutivamente en células de mieloma múltiple (MM) y tiene un notable efecto anti-MM60. ITGB7 se une a la integrina α4 para formar la integrina α4β7, que es un receptor de superficie celular heterodimérico expresado en la mayoría de los leucocitos61. La integrina α4β7 participa en varios pasos durante la aterogénesis en ratones, y la regulación positiva de la integrina α4β7 se asocia con la progresión de las lesiones aterogénicas62.

El antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos, también denominado LFA-1 o αLβ2, es una integrina de células T fundamental para regular la activación y migración de las células T63. Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha informado que ITGAL sea directamente relevante para la progresión de las NAC. Estudios anteriores han demostrado que ITGAL afecta la formación de células espumosas en macrófagos al regular la absorción de Ac-LDL64.

Los resultados del análisis de enriquecimiento de DO de los genes de diagnóstico mostraron que estos genes estaban significativamente enriquecidos en la tuberculosis, la enfermedad infecciosa del virus de la inmunodeficiencia humana y la enfermedad de inmunodeficiencia primaria. CD4 es el receptor de la proteína de la envoltura del VIH gp120; por tanto, el VIH puede infectar selectivamente las células T CD4+ para provocar el SIDA. Estudios anteriores sugieren que el fenotipo de las poblaciones de macrófagos puede influir en gran medida en la progresión de la tuberculosis y el resultado de la infección durante el período desde la infección temprana hasta la formación de granulomas65. El fenotipo M2 incluye múltiples formas de macrófagos activados no clásicamente con propiedades antiinflamatorias, angiogénicas e inmunomoduladoras dirigidas por Th2. Estudios anteriores han concluido que durante la infección tuberculosa activa, los monocitos humanos tienden a diferenciarse en macrófagos antiinflamatorios (tipo M2) que muestran una mayor motilidad dependiente de proteasa, supervivencia de patógenos y propiedades inmunomoduladoras66.

En el presente estudio, también utilizamos la DGIdb para detectar varios fármacos de molécula pequeña con posible eficacia terapéutica contra los CAP. Se ha demostrado que algunos de ellos, como el imatinib, tienen efectos anticancerígenos para el tratamiento de la leucemia mieloide crónica y los tumores del estroma gastrointestinal67. Estudios anteriores también han demostrado que imatinib puede disminuir y normalizar la hiperlipidemia, lo que indica que imatinib puede atenuar el desarrollo de CAP. Por lo tanto, estos fármacos de molécula pequeña identificados podrían tener un potencial significativo para inhibir la progresión de los CAP68.

El presente estudio tiene algunas limitaciones. Primero, el uso de tres muestras para validar el análisis ROC es inadecuado. En segundo lugar, debido a la pequeña cantidad de conjuntos de datos que eran apropiados para este estudio, seleccionamos solo conjuntos de datos de microarrays en lugar de conjuntos de datos de secuenciación de molécula única y RNA-seq. Nuestra investigación futura se centrará en cerrar la brecha en esta área. En tercer lugar, analizamos sólo los genes que podrían estar relacionados con los CAP, sin un análisis en profundidad de la localización del subtipo celular. Planeamos realizar un nuevo estudio que inscribirá a más pacientes y múltiples tipos de conjuntos de datos para verificar la confiabilidad de los genes centrales.

En resumen, identificamos por primera vez 7 genes diferenciales inmunorelacionados entre CAP y muestras de arteria carótida normal, que incluyeron BTK, LYN, PTPN11, CD163, CD4, ITGAL e ITGB7; Este hallazgo podría ser fundamental para comprender el proceso de las CAP y servir como objetivos potenciales de la inmunoterapia. En el futuro, verificaremos aún más la exactitud de nuestros resultados mediante experimentos relevantes en muestras de tejido clínico.

Los conjuntos de datos están disponibles en la base de datos GEO. GSE43292 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi), GSE100927 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi).

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Agradecemos el apoyo del Departamento de Cirugía Vascular del Hospital Chaoyang de Beijing y de Guo-Jiang Zhao, Departamento de Urología del Hospital Chaoyang de Beijing de la Universidad Médica Capital.

Estos autores contribuyeron igualmente: Hualiang Ren y Chunmin Li.

Departamento de Cirugía Vascular, Hospital Chaoyang de Beijing, Universidad Médica Capital, Beijing, China

Kai Zheng, Wentao Yang, Shengxing Wang, Mingsheng Sun, Zhenyi Jin, Wangde Zhang, Hualiang Ren y Chunmin Li

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KZ, HR y CL diseñaron el estudio. KZ y WY realizaron análisis bioinformáticos. KZ, WY, SW y MS redactaron el manuscrito. CL, HR y WZ contribuyeron a la revisión del manuscrito. Todos los autores aprobaron el manuscrito final presentado.

Correspondencia a Hualiang Ren o Chunmin Li.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Zheng, K., Yang, W., Wang, S. et al. Identificación de biomarcadores relacionados con la infiltración inmune en placas ateroscleróticas carotídeas. Representante científico 13, 14153 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40530-w

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Recibido: 26 de diciembre de 2022

Aceptado: 11 de agosto de 2023

Publicado: 29 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40530-w

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